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01
Introduction
生物反應(yīng)器是用于微生物和細(xì)胞的體外培養(yǎng),并通過生化反應(yīng)或發(fā)酵過程獲取產(chǎn)物的裝置,是生物合成、生物發(fā)酵、生物制藥領(lǐng)域中關(guān)鍵的設(shè)備之一。而平行生物反應(yīng)器可同一系統(tǒng)控制多個(gè)單元,使其保持各項(xiàng)參數(shù)的高度一致性,是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計(jì)方案重要的環(huán)節(jié),其核心功能是高通量篩選(high-throughput screening)和工藝放大。
02
Application
Background
藻藍(lán)素(Phycocyanobilin,PCB)天然存在于藍(lán)藻光感應(yīng)系統(tǒng)中,在光能的吸收和傳遞中起著至關(guān)重要的作用,在光遺傳學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用。由于其具有亮麗的天藍(lán)色,可以作為天然色素在食品飲料中呈色,安全健康,營養(yǎng)豐富,是FDA唯一批準(zhǔn)的藍(lán)色食品添加劑。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復(fù)細(xì)胞延緩衰老、保水抗凍的作用,廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。此外,作為一種安全的藥物,口服PCB在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為NADPH氧化酶的有效抑制劑,在治療阿爾茨海默癥方面表現(xiàn)出巨大潛力;PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用,有潛力應(yīng)用于防治近年來爆發(fā)的新型冠狀肺炎病毒。目前,PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題:(1) 甲醇高溫?zé)峤庑枰馁M(fèi)大量的能量,造成能源浪費(fèi);(2) 螺旋藻中與PCB共存的其他色素,如葉綠素、葉黃素等一系列前體,對后期產(chǎn)物純化有不利影響;(3)螺旋藻生長周期較長,限制了藻藍(lán)素的生產(chǎn)效率和應(yīng)用。因此,從天然藻類中提取高純度的PCB是一項(xiàng)復(fù)雜且不經(jīng)濟(jì)的方法,而采用合成生物學(xué)的方法合成PCB具有降低成本、節(jié)約能源和提高純度的優(yōu)點(diǎn),目前已有研究人員在5 L發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)了PCB世界最高水平合成。
Strategy
首先,通過比較選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA來合成PCB,在此基礎(chǔ)上,確定了含有強(qiáng)誘導(dǎo)啟動子(T7lac)的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pRSFDuet-1)最適合表達(dá)這兩種酶(圖1,圖2)。
▲圖1 用于PCB合成的模塊?;疑珔^(qū)域包括參與ALA替代途徑(C4或C5途徑)的酶合成;紅色區(qū)域包括參與血紅素合成的酶和中間體;藍(lán)色區(qū)域包括參與PCB合成的酶和輔酶因子。
Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.
▲圖2優(yōu)化HO和PcyA的表達(dá)策略以合成藻藍(lán)素。(a)從不同來源選擇HO和PcyA;(b)HO1和PcyA表達(dá)的質(zhì)粒和啟動子的優(yōu)化。藍(lán)色和深灰色條表示PCB和分別為OD600。
Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.
此外,在中等拷貝數(shù)的pCDFDuet-1載體中,采用DNA支架以2:1的比例實(shí)現(xiàn)HO1和PcyA的有效組裝(圖3)。
▲圖3通過DNA支架調(diào)節(jié)HO和PcyA比例促進(jìn)藻藍(lán)素合成
Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.
隨后,通過直接補(bǔ)充血紅素前體ALA和適度過表達(dá)血紅素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(HemB和HemH),增加細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)供應(yīng),促進(jìn)PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應(yīng)都伴隨著鐵氧還蛋白(Fd)和Fd-NADP+還原酶(Fnr)的循環(huán)再生,研究人員通過表達(dá)nadK基因(編碼NAD+激酶)來加速輔因子循環(huán),進(jìn)一步增強(qiáng)了PCB合成(圖4)。
▲圖4 PCB合成中的輔因子增強(qiáng)循環(huán)
Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.
此外,研究人員還通過添加還原劑作為輔助,發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中加入維生素C或谷胱甘肽時(shí),藻藍(lán)素產(chǎn)量會得到提高,進(jìn)一步優(yōu)化了維生素C的添加量,發(fā)現(xiàn)添加5 g/L維生素C時(shí),最適合PCB生產(chǎn)。
最后,分別在搖瓶和發(fā)酵罐水平對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化(圖5)。
▲圖5在5L發(fā)酵罐中放大分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵。(a)分批發(fā)酵;(b)600g補(bǔ)料分批發(fā)酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H2O;(c)通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O和200 mg/L FeSO4·7H2O進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵;(d)通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O、200 mg/L FeSO4·7H2O和5 g/L(NH4)2SO4進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵
Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO4·7H2O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, and 200 mg/L of FeSO4·7H2O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 200 mg/L of FeSO4·7H2O, and 5 g/L (NH4)2SO4
在搖瓶水平,在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導(dǎo),采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L維生素C的MR培養(yǎng)基有利于提高PCB的產(chǎn)量。在發(fā)酵罐水平,采用pH-stat法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵,添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O,在發(fā)酵罐水平獲得藻藍(lán)素28.32 mg/L,是至今報(bào)道的最高產(chǎn)量。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍(lán)素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。
03
Conclusion
提取耗能大、純化復(fù)雜且原料獲取周期長的藻藍(lán)素通過生物合成的方法實(shí)現(xiàn)了目前發(fā)酵最高的產(chǎn)量,以大腸桿菌為工程菌成功構(gòu)建PCB完整代謝通路,通過基因調(diào)控手段(過表達(dá)關(guān)鍵酶及相關(guān)酶上游基因等)和輔料添加來促進(jìn)PCB的合成,再于生物反應(yīng)器內(nèi)對菌種進(jìn)行放大培養(yǎng)并對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,采取補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法在5 L發(fā)酵罐水平獲得了PCB的高產(chǎn)量合成。
合成生物學(xué)是從原料到菌種再到產(chǎn)品的全鏈條設(shè)計(jì)和優(yōu)化,可以在改造和優(yōu)化天然表達(dá)體系的同時(shí),將動物源和植物源的代謝路徑構(gòu)建到微生物體系中,重新合成全新的人工生物體系,最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物的異源表達(dá),將原料以較高的速率最大限度地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。而平行生物反應(yīng)器是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計(jì)方案重要的環(huán)節(jié),其核心功能是高通量篩選和工藝放大,研究目標(biāo)菌種在較大培養(yǎng)體系下的生長行為,優(yōu)化生長pH、補(bǔ)料速度、攪拌速度、誘導(dǎo)劑添加、通氣量等培養(yǎng)條件,實(shí)時(shí)監(jiān)測體系內(nèi)溶氧、溫度等生長參數(shù),多個(gè)反應(yīng)器同時(shí)控制,使發(fā)酵過程一致,發(fā)酵結(jié)果具有一致性與平行性。“新芝·主元”MPB平行生物反應(yīng)器,針對不同培養(yǎng)需求設(shè)計(jì)開發(fā)了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容積的發(fā)酵設(shè)備,單元模塊數(shù)量可按需拓展,適用于菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化、工藝固定的菌種高通量篩選、最適培養(yǎng)基篩選等方向,涉及基因工程、生物制藥、酶工程、合成測序、代謝途徑/ 網(wǎng)路及生物底盤的設(shè)計(jì)與改造等多個(gè)領(lǐng)域。平行生物反應(yīng)器上下游行業(yè)廣泛,是研究合成生物學(xué)的得力助手,如有興趣,期待您的咨詢。
圖源:DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016
寧波新芝生物科技股份有限公司(股票代碼:430685),總部位于寧波市國家高新區(qū),是知名的生物樣品處理設(shè)備提供商,也是國內(nèi)超聲波技術(shù)應(yīng)用探索的先行者。新芝生物是一家為生物醫(yī)藥、醫(yī)療衛(wèi)生、IVD、生物安全、食品安全、疾病預(yù)防與控制、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境保護(hù)及新材料研究等諸多領(lǐng)域提供相關(guān)科學(xué)儀器的高新技術(shù)企業(yè)。
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