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微生物生長曲線分析儀菌密度的小知識:大小和形狀的影響

上過微生物相關(guān)課程的同學(xué),大抵都對菌液的OD600測量還有點印象:需要將樣本稀釋到合適的濃度,然后取樣置于比色皿內(nèi),在分光光度計中測量600nm波長下的OD值。此外,也會有一個模糊的印象,當(dāng)OD為1時1mL菌液中大概對應(yīng)了多少數(shù)量的細(xì)胞。

網(wǎng)絡(luò)搜索1 OD與菌液濃度的對應(yīng)關(guān)系時,發(fā)現(xiàn)給到的數(shù)據(jù)區(qū)間非常大,從1×10^7 ~2×10^9 cells/mL不等,但基本都會提到需要結(jié)合具體的菌種進行分析,培養(yǎng)物中細(xì)菌細(xì)胞的大小和形狀會對OD600數(shù)值產(chǎn)生影響。


細(xì)胞大小對OD600的影響

Keiran Stevenson等研究人員制備了不同直徑的微珠的分散溶液(圖1),每種溶液的濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2A所示,在相同的OD600數(shù)值情況下,隨著微珠的直徑減小,對應(yīng)的微珠濃度顯著增加(圖2B)。

▲圖1 微珠的明場圖像。A:15.7±1.4 μm;B:10.0±0.6 μm;C:3.00±0.07 μm;D:0.96±0.07 μm;E:0.51±0.01 μm。E中給出的刻度尺適用于A-E。

▲圖2  球形微珠懸浮液的OD600測量。(A)對于給定的珠子直徑,微珠懸浮液的濃度與OD600之間的關(guān)系。(B)微珠濃度與微珠直徑之間的關(guān)系,同一條曲線上的點擁有相同的OD600值,隨著箭頭的方向,曲線從黑到紅分別對應(yīng)以下OD600值:0.05、0.1、0.5、1和10。每組5個重復(fù),由于差異較小,部分?jǐn)?shù)據(jù)重疊。


細(xì)胞形狀對OD600的影響

Keiran Stevenson等研究人員還研究了真實的微生物形狀和大小對OD600的影響。不同遺傳背景的酵母、不同生長環(huán)境的大腸桿菌的顯微鏡圖片如圖3所示:酵母二倍體的體積大于酵母單倍體(圖3B-D);大腸桿菌在亞致死濃度氨芐西林(ampicillin)的作用下被誘導(dǎo)成絲狀(圖3E);對數(shù)生長期的大腸桿菌繁殖活躍,個體較大(圖3F);穩(wěn)定期后期部分細(xì)胞死亡,個體較?。▓D3H);穩(wěn)定期前期的大腸桿菌體積處于兩者之間(圖3G)。

▲圖3  在顯微鏡下獲得的不同微生物的代表性圖像。(B)酵母CLN3Δ純合二倍體突變體;(C)酵母二倍體;(D)酵母單倍體;(E)在亞致死濃度氨芐西林(ampicillin)存在下生長的大腸桿菌細(xì)胞,呈絲狀;(F)對數(shù)生長期的大腸桿菌細(xì)胞;(G)穩(wěn)定期早期的大腸桿菌細(xì)胞;(H)穩(wěn)定期晚期的大腸桿菌細(xì)胞。B中給出的刻度尺適用于B-H。


這些微生物培養(yǎng)液的濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,與正常的大腸桿菌樣品相比,經(jīng)抗生素氨芐西林誘導(dǎo)的絲狀大腸桿菌細(xì)胞的校準(zhǔn)曲線變化較大。酵母(細(xì)胞尺寸4~6μm)的細(xì)胞大小變化對校準(zhǔn)曲線的影響要比細(xì)菌(細(xì)胞尺寸0.7~1.5μm)的影響要小。

 ▲圖4  微生物濃度與OD600之間的關(guān)系。酵母CLN3Δ純合二倍體突變體(深灰)、酵母二倍體(淺灰)、酵母單倍體(紫色)、絲狀大腸桿菌(綠色)、以及對數(shù)生長期(黑色)、穩(wěn)定期早期(藍(lán)色)和晚期(紅色)的大腸桿菌。

綜上所示,微生物的形狀和大小都會對OD600測量產(chǎn)生影響,因此當(dāng)需要通過OD600來估算菌液濃度時,不同的微生物需要單獨制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。


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參考文獻(xiàn)

Stevenson K ,  Mcvey A F ,  Clark I , et al. General calibration of microbial growth in microplate readers[J]. Scientific Reports, 2016, 6:38828.


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