【標(biāo)題頁】
生物化學(xué)與分子生物學(xué)虛擬實(shí)驗(yàn)室
點(diǎn)擊按鈕：基礎(chǔ)知識（以下為一組）：
1實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>2實(shí)驗(yàn)原理、3注意事項(xiàng)、4關(guān)鍵試劑與實(shí)驗(yàn)器材
虛擬實(shí)驗(yàn)（以下為一組）：
1 總RNA提取、2 逆轉(zhuǎn)錄、3PCR反應(yīng)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/b>熟悉RT-PCR的反應(yīng)原理、掌握RT-PCR反應(yīng)的操作步驟及RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法。
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【實(shí)驗(yàn)原理】
實(shí)驗(yàn)原理：
聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction PCR）或稱體外基因倍增，是一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR技術(shù)即在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合的酶促反應(yīng)。其特異性取決于引物與模板DNA結(jié)合的特異性。
PCR技術(shù)一般需進(jìn)行以下三個過程：
變性：加熱模板DNA，使雙鏈DNA分子解離成單鏈DNA。
退火：當(dāng)溫度下降時，引物DNA與所要擴(kuò)增基因兩側(cè)的DNA配對形成局部雜交鏈。
延伸：在合適的溫度，合適的緩沖液，Mg2+及4種dNTP存在條件下，DNA聚合酶引物3’-OH游離端，根據(jù)模板的堿基順序合成新的互補(bǔ)鏈。
上述三個過程即變性-退火-延伸為一個循環(huán)，如此重復(fù)進(jìn)行，經(jīng)30次左右的循環(huán)，模板DNA在數(shù)小時擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n。X為擴(kuò)增效率，n為循環(huán)次數(shù)。
逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）又稱RNA-PCR，首先提取組織細(xì)胞總RNA，加入與mRNA3’端互補(bǔ)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，然后以cDNA為PCR模板，加入與cDNA互補(bǔ)的另一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR可用于cDNA克隆，cDNA文庫構(gòu)建，基因表達(dá)研究等。
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【注意事項(xiàng)】
在所有的RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗 的主要原因是RNA酶的污染。
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【關(guān)鍵試劑與實(shí)驗(yàn)器材】
關(guān)鍵試劑：Trizol、氯仿、異丙醇、1%的DEPC水、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒
實(shí)驗(yàn)器材：電動勻漿器、振蕩器、冷凍離心機(jī)、小型臺式高速離心機(jī)、常規(guī)PCR儀、電泳儀、紫外分光光度計(jì)等。
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